Mielas mikrobasas

Share Tweet Pin it

Nuo "Pasteur" žinoma, kad žmogaus virškinimo traktas iš esmės yra srauto tipo bioreaktorius, kuriame gyvena daug mikroorganizmų. Žmonių požiūris į žarnyno mikroflorą per šį laiką radikaliai pasikeitė. Prieš šimtą metų, didysis Ilja Mechnikov, šiuolaikinės teorijos imuniteto įkūrėjas, kūrimui, kurių jis gavo Nobelio premiją (dviems žmonėms su jo nenumaldomas priešininkas, ne mažiau nei puikus Paulius Ehrlich), net pasiūlė dvitaškis šalinimas kaip prailginti gyvenimo būdas. Ir tiems, kuriems ši priemonė atrodė pernelyg radikali, aš rekomendavo gerti kuo daugiau kefyro, kad galėtumėte slopinti kenksmingus, jo nuomone, mikrobus su naudingomis pieno rūgšties bakterijomis. Po pusės amžiaus kursas pasikeitė 180 laipsnių. Paaiškėjo, kad normalus žarnyno mikrofloras, o taip pat oda ir gleivinės, atlieka daug naudingų funkcijų - pavyzdžiui, jis slopina patogeninių mikroorganizmų gyvybinę veiklą, nuolat atakuoja kūną. Ir pastaraisiais metais labiausiai drąsūs mikrobiologai nuėjo dar toliau, paskelbdami žmogų ir jo mikrobus kaip vieną simbiotinį superorganizmą.

Molekulinės biologijos metodų kūrimas atvedė mokslininkus į naują supratimą apie žmogaus ir jo mikrofloros simbiozės procesus, kurie, atrodo, buvo gerai ištyrę ir kurių tyrimo metu nebuvo tikėtinų ypatingų staigmenų. Greitas greitis ir DNR sekos nustatymo metodų (nustatant jo nukleotidų seka) ir lygiagrečiai didėjant asmeninių kompiuterių galiai ir interneto plėtojimui sumažėjo išlaidos, leidžiančios išanalizuoti informaciją apie didelius genomo regionus. Po to, kai šimtų atskirų bakterijų rūšių chromosomos buvo iššifruotos, mikroorganizmų genetikoje atsirado naujas požiūris - populiacijos metodas: analizuojant visų bakterijų genus, kurie vienu metu gyvena konkrečioje srityje. Žinoma, "žmogaus bioreaktoriaus" populiacija pasirodė esanti viena iš svarbiausių mikrobų populiacijų tyrimo.

Pirmasis darbas, kuris paskatino naują žvilgančių mikrobiota pažvelgti, 1999 m. Buvo paskelbtas Nacionalinio agronominių tyrimų instituto (Prancūzija) ir Readingo universiteto (Jungtinė Karalystė) mokslininkų grupės. Autoriai nusprendė taikyti 16S RNR genų sekvenavimo metodą žarnyno mikrobų populiacijos tyrimui.

16S RNR - bakterijų ID

Kadangi "Pasteur", pirmasis ir būtinas žingsnis nustatant mikroorganizmus buvo jų auginimas maistingųjų medžiagų terpėje. Tačiau daugelis svarbių (ir naudingų, ir patogeniškų) mikrobų nenori augti jokiame terpėje. Studijų anksčiau neprieinama nesidaugina bakterijos ir pradeda išvalyti visiškai paini taksonomiją žinomų prokariotų tapo įmanoma su bioinformatikos vystymuisi ir šiuolaikinių molekulinės biologijos metodus atėjimas - polimerazės grandininė reakcija (PGR), kuri leidžia vieną gabalėlį DNR gauti milijonus ir milijardus tikslios kopijos, klonai izoliuotas nuo naudojant PCR genus bakterijų plazmose ir sekos nustatymo metodai nukleotidų sekas, gaunamas dėl to, kad visa tai yra pakankama ana Iza suma.

Idealus mikroorganizmų identifikavimo žymeklis buvo genų, koduojančių 16S ribosominę RNR (kiekvienas iš dviejų ribozmo subvienetų - baltymų sintezės baterijų dirbtuvės - susideda iš susipynusių baltymų molekulių ir ribonukleicinių rūgščių grandinių).

Šis genas yra visų žinomų bakterijų ir archeų genomo, bet jis nėra eukariotams ir virusams, o jei jūs nustatėte savo būdingą nukleotidų seką, jūs tikrai elgiatės su prokariotų genais. (Būtinai tiksliai, 16S RNR genas taip pat egzistuoja eukariotuose, bet ne branduolinės chromosomos, bet mitochondrijų chromosomosose. Tai dar kartą patvirtina, kad mitochondrijos yra tolimos pirmosios eukariotės organizmų simbionų palikuonių palikuonys.)

Šis genas turi tiek konservatyvius regionus, tiek ir visiems prokariotams ir konkrečioms rūšims. Konservatyvios svetainės naudojamos pirmajam polimerazės grandininės reakcijos etapui - bandomosios DNR priklijuojamos į pradmenis (DNR sėklų patalpos, į kurias tiriamajai nukleotidų grandinei reikia prisijungti, kad būtų galima pradėti analizuoti likusius sekos etapus), o konkrečiai rūšiai - rūšiai nustatyti. Be to, rūšių, panašių į rūšis, pasiskirstymas labai gerai atspindi skirtingų rūšių evoliucinę giminingumą.

Papildoma priemoka yra klonavimui ir tolesnei analizei, galite naudoti pačią ribosominę RNR, kuri bet kurioje ląstelėje yra daug didesniame kiekyje nei jo atitinkamas genas. Tik jūs pirmiausia turite "perrašyti" į DNR naudojant specialų fermentą - atvirkštinę transkriptazę.

Visų žinomų bakterijų ir archeų (apie 10 000 rūšių) 16S RNR nukleotidų sekos yra plačiai prieinamos. Nustatytos sekos palyginamos su duomenimis bazėse ir tiksliai identifikuojamos bakterijų rūšys arba pripažįstama, kad ji priklauso kitoms nekultivuotoms rūšims.

Pastaruoju metu buvo intensyviai persvarstyta senoji, fenotipinė bakterijų klasifikacija, pagrįsta blogai formalizuotomis kriterijais: nuo kolonijų atsiradimo iki maisto pasirinkimo ir gebėjimo būti dažytais įvairiais dažais. Naujoji sistematika pagrįsta molekuliniais kriterijais (16S RNR) ir tik iš dalies pakartoja fenotipinę.

Koduojančių sekų 16S RNR PGR metodu buvo aptikta tiesiogiai iš "aplinka" - 125 miligramų žmogaus, klaida, išmatose, buvo įterptas į E. coli (plazmidės ne todėl, kad žarnyno, ir dėl to, Escherichia coli - viena iš mėgstamiausia Workhorse molekulinės biologijos ) ir vėl izoliuota nuo dauginamos bakterijos kultūros. Taigi, buvo sukurtas visų mėginių mikroorganizmų 16S RNR genų biblioteka. Po to 284 klonai buvo atsitiktinai parinkti ir sekvencuoti. Pasirodo, kad tik 24% gautų 16S RNR sekų priklausė anksčiau žinomiems mikroorganizmams. Daugiau nei šimtą metų trys ketvirtadaliai kiekvieno žmogaus žarnyno mikrofloros vengia mokslininkų, ginkluotų klasikinės mikrobiologijos metodais, dėmesį! Mokslininkai tiesiog negalėjo rasti šių bakterijų auginimo sąlygų, nes labiausiai nerūpestingos žarnyno gyventojai atsisakė augti tradicinėje mikrobiologinėje terpėje.

Šiandien, naudojant molekulinius metodus, buvo nustatyta, kad 10 iš 70 didelių bakterijų taksonų yra suaugusio mikrobiota. Apie 90% mūsų mikrobų priklauso firmų tipams (pvz., Gerai žinomos laktobakterijos yra pagrindiniai pieno sūriai "kaltininkai"), o "Bacteroidetes" yra obligaciniai anaerobai (organizmai, kurie gali gyventi tik be deguonies), kurie dažnai naudojami kaip taršos rodiklis natūralių vandenų nuotekos. Likę 10% gyventojų padalintas tarp taksonų proteobakterijos (Tai apima, be kita ko, E. coli), Actinobacteria (nuo vienos iš aktinomicetų antibiotikų streptomicino rūšių buvo izoliuotas), Fusobacteria (normalus gyventojų burnos ertmės ir dažnai sukelia periodontitas), Verrucomicrobia (neseniai nustatyta, kad geoterminis šaltinis yra šių mikrobų rūšis, kurios maitinasi metanu, kuris dėl žarnyno gausos dėl kitų mikroorganizmų gyvybinės aktyvumo), cianobacteria (jie vis dar dažnai vadinami senais pavadinimais "mėlynaisiais dumbliais"), Spirochaeaters ( tew, ne blynas), Synergistes ir VadinBE97 (kokie gyvūnai yra tie, klauskite naujos prokariotinės sistemtikos kūrėjų).

Nepaisant to, kad žarnyno mikroorganizmų rūšinė sudėtis yra gana vienarūšė, tam tikrų sisteminių grupių atstovų kiekybinis santykis skirtingų žmonių mikrobiota gali labai skirtis. Bet kas yra normalus žarnyno mikrofloras ir kokie yra jo formavimo būdai?

Šis klausimas buvo pateiktas 2007 m. Stanfordo universiteto Patrick Browno vadovaujamos Amerikos biologų grupės darbe. Per pirmuosius gyvenimo metus jie atsirado 14 naujagimių mikrobiota. Autoriai sugebėjo nustatyti keletą kolonizacijos virškinimo trakto šaltinių šaltinių. Kūdikių mikrobiotai turėjo panašumų su motinos mikroflora: makšties, fekalijos ar motinos pieno mėginių mikrofloros. Priklausomai nuo kolonizacijos šaltinių, pirmųjų gyvenimo metų metu žinduolių mikrofloroje dominavo skirtingos rūšys. Šie skirtumai išliko reikšmingi visą studijų laikotarpį, tačiau vienerių metų amžiuje pastebimas suaugusiųjų mikrobiota susidarymas. Įdomūs duomenys buvo gauti dvynių poros pavyzdžiu. Juose mikroflorai buvo beveik identiški ir taip pat pasikeitė. Ši išvada parodė milžinišką mikrobiota šeimininko poros žmogaus sudedamąsias dalis žarnyno mikrofloros populiacijos formavime. Žinoma, norint išgryninti eksperimentą, būtina atskirti kūdikius, kol jie liko ligoninėje - puiki istorija, skirta Indijos filmei! Per metus jie susipažįsta tarpusavyje analizę... Bet kitų darbų duomenys patvirtino prielaidą, kad žmogaus, įskaitant paveldimus žmogaus biocheminius bruožus, didelė įtaka mikrobiota sudėčiai.

Mikrobinis mus yra labiau nei žmogus

Be to, kai tyrinėja tam tikrų tipų žarnyno mikroflorą, pastaraisiais metais daugelis mokslininkų ištyrė žmogaus žarnyno turinį (išplovus iš odos arba jūros dugno paviršiaus ėminio mėginį) bakterijų metagenas - visų mikroorganizmų genų rinkinį. Šiam tikslui, labiausiai automatizuota, kompiuterizuotas ir aukštos kokybės DNR sekos sudarymo technologijos, kurios leidžia analizuoti, trumpus nukleotidų sekas, surinkti dėlionės kelias, sutampančią "raidės" ne iš šių dalių galuose, išsėtinės pakartoti šią procedūrą kiekvienam genomo gabalo ir gauti dekodavimo atskirų genų ir chromosomų tokiu greičiu iki 14 milijonų nukleotidų per valandą - greičiau, nei tai buvo daroma prieš kelerius metus. Taigi buvo nustatyta, kad žmogaus žarnyno mikrobiota turi maždaug 100 trilijonų bakterijų, ty apie 10 kartų daugiau nei bendras ląstelių kiekis priimančioje organizme. Genų, sudarančių bakterijų metagenomą, rinkinys yra maždaug 100 kartų didesnis už žmogaus kūno genų rinkinį. Jei mes kalbame apie mikroorganizmų populiacijoje esančių biocheminių reakcijų kiekį, tai yra daug kartų didesnė negu žmogaus organizme. Bakterinė "reaktorius" įgyvendina į pagrindinę medžiagų apykaitos grandinėje, kad tai nėra pajėgi remti pati - pavyzdžiui, vitaminų sintezė ir jų pirmtakai, kai kurių toksinų, skilimas, skilimo iš celiuliozės į virškinamų polisacharidų (atrajotojams), ir tt

Jeffrey Gordon (Vašingtono universiteto Vaikų ligoninės Vaikų medicinos universiteto, St. Louis, Missouri) laboratorijoje atlikti tyrimai leido susieti virškinamojo trakto bakterijų rūšinę įvairovę su žmogaus mityba ir metabolinėmis savybėmis. Eksperimento rezultatai buvo paskelbti 2006 m. Gruodžio mėn. "Gamtos" numeryje. Vienerių metų eksperimentas pasiūlė nustatyti koreliaciją tarp žmogaus liekninio svorio ir žarnyno mikrobų populiacijos sudėties. Dešimt riebalų žmonių, kurie sutiko paversti savo skrandžius mokslo altoriuje, buvo suskirstyti į dvi grupes. Vienas iš jų vartojo mažai riebalų turinčią dietą, kita - dietą su mažu angliavandeniu. Visi savanoriai prarado svorį ir tuo pačiu metu pakeitė dviejų pagrindinių žarnyno mikroorganizmų grupių santykį: sumažėjo Firmicutes ląstelių skaičius, o priešingai - padidėjo bakteriodezių skaičius. Mažai riebalų dieta toks pakeitimas tapo pastebimas vėliau - po to, kai pacientai prarado 6% savo svorio, o mažai angliavandenių dietos - praradę pirmuosius kilogramus (2% jų pradinio svorio). Tuo pačiu metu, mikrofloros sudėtis pasikeitė dar ryškesnė, tuo mažiau tapo eksperimento dalyvių svoris.

Tuo pačiu metu toje pačioje laboratorijoje buvo atlikti eksperimentai su laboratorinėmis pelėmis, atliekančiomis leptino geno mutaciją - "sotumo hormoną" - baltymą, kuris sintezuojamas riebalinio audinio ląstelėse ir prisideda prie sotumo jausmo susidarymo. Pelės, kurios pažeisdavo abiejų šio geno kopijas (ši mutacija nurodoma Lep ob indeksu), valgė 70% daugiau negu laukinio tipo, su visomis iš to kylančiomis pasekmėmis. Firmicutes kiekis jų žarnose yra pusantro karto didesnis nei heterozigotinių linijų turinys, turintis tik vieną defektų alelį (ob / +) ir homozigotinis laukinio tipo linijų normaliam genui (+ / +).

Mikrofloro įtaka jo "savininko" metabolizmui, mokslininkai patikrino kitu modeliu - gnotobioticheskimi pelės.

Tokie gyvūnai, kurie nuo gimimo momento gyvena steriliose kamerose ir niekada neatitinka vieno mikrobų savo gyvenime, biomediciniuose tyrimuose dažnai nenaudojami. Absoliutis sterilumas raumenyse, triušiuose ir ypač ožkų namuose yra brangus ir varginantis, o po susitikimo su pirmuoju mikrobu ar virusu, prastos būtybės miršta arba tampa netinkamos tolesniems eksperimentams. Kas vyksta gnotobiotovuose su imunine sistema yra atskira istorija, ir jie valgo tris ir tuo pačiu metu - odą ir kaulus, nes trūksta mikroorganizmų virškinimo komponento.

Po transplantacijos iš nutukusių (ob / ob) donorų mikrofloros, gnatobiot pelė per dvi savaites sustorėjo beveik pusantro karto (47%). Tie, kurie buvo "sėjami" su laukinio tipo (+ / +) donorų, kurių normalaus svorio, mikroflora buvo išauginta tik 27%.

Tolimesnio simbiozinio pelių ir mikrobų organizmo pokyčių tyrimo rezultatai puikiai patvirtino hipotezę, kad nutukusių žmonių mikrobiota prisideda prie gilesnio maisto perdirbimo. Nutukimo ir normalaus pelių DNR mėginių išmatų palyginimas parodė, kad nutukimo mikrobiomos yra prisotintos fermentų genais, kurie leidžia efektyviau skaidyti polisacharidus. Riebalų pelių žarnose buvo daug fermentavimo galutinių produktų - acto rūgšties ir sviesto rūgščių junginių, kurie rodo gilesnį maisto komponentų perdirbimą. Kalorimetrinis (iš žodžio "kalorijos"!) Tyrimų su išmatomis analizė patvirtino tai: ob / ob pelių išmatose buvo mažiau kalorijų nei laukinės rūšies pelėms, kurios nevisiškai absorbavo energiją iš maisto.

Be to, svarbi informacija apie "gemalo" komponento nutukimo, autoriai galėjo parodyti esminį panašumą tarp nutukusių žmonių ir pelių mikrofloros, kuri atveria naujas perspektyvas dėl antsvorio problemos tyrimo, o galbūt - ir išspręsti šią problemą "perdavimo" sveikos mikrofloros ar jo formavimosi pacientams nutukusi.

Tai, kad mikrobiota gali kontroliuoti šeimininko metabolizmą, nebegali abejoti. Gordono tyrimas dėl perteklinio svorio leido tiltui į medžiagų apykaitos ligų, tokių kaip bendras išsekimas, turintis poveikį vienerių ar ketverių metų vaikams neturtingose ​​šalyse, turinčiose tropinį klimatą - marasmą (šis žodis turi tik lingvistinį ryšį su marasmu: graikų marasmosu tiesiog reiškia išnykimą, išnykimą) ir kwashiorkor (vieno Gano giminės kalbos kalba - kwashiorkor - "raudonasis berniukas"). Ligos atsiradimas yra susijęs su baltymų ir vitaminų trūkumu pereinant nuo maitinimo krūtimi į suaugę maistą. Tačiau liga selektyviai paveikia vaikus, kurių broliai ir seserys neturėjo jokių problemų pereinant prie tradicinės regiono mitybos. Tyrimai parodė, kad sergančių vaikų žarnyno mikrofloras labai skiriasi nuo tėvų mikrofloros, taip pat nuo sveikų brolių ir seserų mikrofloros. Visų pirma buvo pastebėta beveik visiško bakteroidų žarnyno populiacijos nebuvimas ir retų rūšių, priklausančių proteobakterijų ir fosobakterijų rūšims, dominavimas. Po sergančių vaikų (kruopščiai, kad nebūtų perdozavimo!) Buvo tiekiami intensyviai baltyminiai maisto produktai, jų mikrobiota tapo panaši į įprastą, kaip antai giminaičiuose, kuriuose dominavo Bacteroidetes ir Firmicutes.

Naujausi tyrimai ne tik iš esmės pakeitė dabartinį žmogaus žarnyno mikrofloros supratimą, bet ir prisidėjo prie koncepcijos, pagal kurią žarnyno mikrobiota laikoma papildomu daugelio elementų "organu" žmogaus kūne, atsiradimą. Organas, susidedantis iš įvairių ląstelių linijų, galinčių bendrauti tarpusavyje ir su šeimininku. Kūnas, kuris perskirsto energijos srautus, atlieka svarbias fiziologines reakcijas, keičiasi aplinkos įtakoje ir savireguliavo, kai pokyčius sukelia išorinės sąlygos.

Tęsinys tyrimai "bakterijų organizmas" gali ir turi sąlygoti tos sistemos funkcionavimo, jo subtilus santykius su priimančiosios atskleidimo įstatymų supratimo ir, kaip pasekmė, naujų metodų kovai su žmogaus ligomis, tikslingai gydyti sutrikimus abiejų metaorganizma komponentų atsiradimą.

Valerijus Poroikas, Ph.D.
Čikagos universitetas, Bendrosios chirurgijos katedra
Portalas "Amžinojo jaunimo" www.vechnayamolodost.ru

Žurnalo versija, paskelbta Populiariosios mechanikos Nr. 4-2008

Bakterijų rūšies identifikavimas, sekvenuojant ribosominės RNR geną 16S, metodo vaidmuo ir vieta bakterinės infekcijos diagnozėje. Baigta: Savelievas. - pristatymas

Prieš 4 metus Ludmila Šumikhina pristatė pristatymą

Susiję pristatymai

11 klasės pristatymas tema: "Bakterijų identifikavimas pagal rūšis, nustatant ribosominės RNR geno 16S, metodo vaidmuo ir vieta bakterinės infekcijos diagnozėje. Baigta: Savelievas". Atsisiųskite nemokamai ir be registracijos. - transkribavimas:

1 Bakterijų rūšies identifikavimas, sekvenavus ribosominės RNR 16S geną, metodo vaidmuo ir vieta bakterijų infekcijoms diagnozuoti : Cand. Biol. Афонюшкин Vasilijus Nikolajevičius daktaras Biol. Афонюшкин Василий Николаевич

2 tikslai: 1. tikriesiems DNR elektroforezės agarozės gelyje 2. Išmokti analizei sekos nustatymo rezultatų metodą, ir atlieka nukleotidų sekų, genų fragmentų, 16 S ribosomų RNR izoliatų gauti šeimininką bacilų genties 1. DNR elektroforezės agarozės gelyje 2. Išmokti analizavimo būdas, sekvenavimo rezultatai ir atlikti iš Bacillus 3 genties izoliatų ribosominės RNR 16S geno fragmentų nukleotidų sekas. Išnagrinėti bendrosios sekos nustatymo ir biochemijos naudojimo perspektyvas. cal identifikavimas bakterijų 3. ištirti dalintis sekos metodus perspektyvas ir biocheminių identifikavimas bakterijų tikslas: išnagrinėti iš konkrečios identifikavimo bakterijų metodo galimybių seka 16S ribosomų RNR kartu su tradiciniais metodais, identifikavimo

3 medžiagos ir metodai Grynosios izoliatų kultūros buvo sėjamos į MPA ir po valandų inkubavimo buvo paruošta bakterinė suspensija fosfato-fiziologinio druskos buferyje. Cultures buvo dažytos Gram ir mikroskopu. Įvertinamos taikant biocheminių savybių: DISPONAVIMAS citrato, malonato, gliukozės, laktozės, manitolio, sacharozės, inozitolio, sorbitolio, arabinozės, maltozės, fenilalanino, formavimo indolas, vandenilio sulfido, atsetilmetilkarabinola (Reakcija Foges- Proskaueris), beta-galaktozidazės, ureazės, arginino dekarboksilazės buvimas ir lizinas, arginino hidrolizė. Išbandytos kultūros katalazės, citochromo oksidazės aktyvumo, nitritų susidarymo, pigmentų sintezės, atsparumo antibiotikams, ištirtos kultūrinės ir morfologinės savybės. Beta-galaktozidazės, ir tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu aktyvumas buvo išbandytas ant vidutinės Uriselekt 4 (BioRad) DNR buvo išskirtas fenolhloroformennym siekiant nustatyto remiantis 16S ribosomos geno RNRi fragmentu tarpgeninę tarpine iš ribosomų RNR ir 16-23S daugybės biocheminių, kultūros ir morfologinės savybės sekos.

4 Kultūrinės savybės: augančios kultūros ant Endo terpės neaugo, t. Y. nebuvo susiję su enterobakterijų, auginami dėl mėsos peptono agaro aerobinėmis sąlygomis 37 ° C temperatūroje Tinctoria savybių: augo tiriami mikroskopiškai kultūra ir Gram dažymo, kuri leido nustatyti, kad gauti kultūra yra sporų Gy + lazdos Charakteristikos Cultures

5 Tyrimo modelis: DNR išskirta iš išaugintų kultūrų ir PCR buvo sukurta su universaliais gruntais, todėl mes amplifikuojame 16S ribosominės RNR geno fragmentą

6 tirpalas su gruntu paskirstomas 4 mėgintuvėliuose, kurių kiekvienoje yra 4 deoksinukleotidai dATP, dTid, dTPP (vienas iš jų pažymėtas radioaktyviu izotopu) ir vienas iš keturių 2; jis aktyvuojamas visose augančios grandinės mišinio padėtyse, o po jo pritvirtinimo grandinės augimas tuoj pat sustoja. Dėl to kiekvienoje iš keturių vamzdelių, dalyvaujant DNR polimerazei, susidaro unikalus įvairių ilgių oligonukleotidų rinkinys, įskaitant pradmenų seką. Be to, į vamzdelius dedama formalizuota medžiaga, skirta grandinių nukrypimui, o elektroforezė poliakrilato gelyje atliekama keturiose juostose. Atliekama radioautografija, kuri leidžia jums "perskaityti" sekvencinio DNR segmento nukleorinę seką. Biochemijoje ir molekulinėje biologijoje elektroforezė yra naudojama atskirti baltymų makromolekules ir nukleorūgštis (taip pat jų fragmentus). Yra daug šio metodo veislių. Šis metodas nustato platų paraišką mišinių biomolekulėse į frakcijas, arba atskirų medžiagų atskyrimo ir yra naudojamas biochemijos, molekulinės biologijos, klinikinių diagnostikos, populiacija biologijos (tirti genetinės variacijos) ir dr.belkovnukleinovyh rūgštys elektroforezės tai elektrokinetinį reiškinys poslinkis dispersinė fazė (koloidas arba baltymas, tirpalai) skystoje arba dujinėje terpėje, veikiant išoriniam elektriniam laukui. Elektros lauko elektrokinetika. Elektroforezė Tyrimo struktūra: PCR produktai buvo atskirti agarozės gelio elektroforeze. Sanger metodas

7 Mūsų pačių tyrimo rezultatai. 1 pav. Ribosomų RNR 16S geno fragmento kapiliarinio elektroforezės rezultatai.

8 pav 2 filogenetinis medis, pagamintas remiantis ribosominės RNR geno 16S fragmento išlyginimo rezultatais

9 Savo tyrimǐ rezultatai Pav. 3 Rezultatų palyginimas nukleotidų seka

10 rezultatai biocheminiai tyrimai kultūrų, naudojant bandymo PBDE biochemines savybes padermės B.licheniformis: neigiamo panaudojimo citrato, malonato neigiamas, natrio citrato + gliukozės neigiamas neigiamas lizino, arginino neigiamas, neigiamas ornitino, fenilalanino neigiamas, indolo neigiamas, ureazės teigiamas atsetilmetilkarabinol neigiamai sulfidą neigiamas, gliukozės teigiamas, b-galaktozidazės teigiamas, laktozės neigiamas, skatina teigiamą poveikį, teigiamas sacharozės, teigiamas inozitolis oh, sorbitolis yra teigiamas, maltozė yra teigiama

11 Išvada rūšių identifikavimas mikroorganizmų ant sekos pagrindu gali būti "aukso standartas" laboratorinės diagnostikos, bet metodo tikslumas yra ribotas patikimumo ir išsamumo duomenų bazėje GenBank ir todėl reikalauja papildomų patvirtinamųjų bandymų naudoti.

16s rna analizė

Biotechnologija, 2005, № 6, p. 3-11

Siūlomas mikroorganizmų identifikavimo metodas, pagrįstas 16S RNR geno PNR gaminio, kurio ilgis 1500 nukleotidų, ilgio polimorfizmo restrikcijos fragmentų (PDFR) analizę. Parinktas 6 restrikcijos endonukleazių rinkinys (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI ir RsaI), kuris leidžia identifikuoti daugelį mikroorganizmų, naudojant PCGF.
Iš natūralių jūros vandens izoliatų išskiriami keturi šiluminės šarminės fosfatazės izoliatai. Šių štamų PDFR analizė, palyginti su apskaičiuotomis rezultatais, gaunamais skirtingų mikroorganizmų 16S RNR genams, leido nustatyti, kad nustatyti gamintojai priklauso Alteromonas genties.

Kartu su tradiciniais mikroorganizmų nustatymo metodais, kuriuose naudojamos kultūrinės ir morfologinės savybės, taip pat cheminės ir biocheminės reakcijos [1], mikroorganizmų nustatymo metodai, pagrįsti įvairių genu mikroorganizmų nukleotidų sekų palyginimu [2-4] ir DNR restrikcijos fragmentų ilgių, gautų atskirų bakterijų genų amplifikacijos polimorfizmu, analizė [5, 6]. Genai, koduojantys 16S ir 23S ribosominę RNR, labiausiai tinka identifikavimui, nes jie yra visų bakterijų ląstelėse ir būdingi genams daugumai mikroorganizmų [7-9]. Dvigubo fragmento, kuriame yra tiek 16S, ir 23S RNR genai ir jų tarpas, naudojimas gali būti naudojamas siekiant nustatyti glaudžiai susijusias mikroorganizmų rūšis ir porūšius [10].

Šiame dokumente pateikiami RFLP analizės PCR produkto 1500 nukleotidų rezultatų ilgio skirtingų mikroorganizmų ir parodė, kad apribojimo naudojimas endonukleazėmis 6 Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI RsaI ir gali patikimai nustatyti daugumą mikroorganizmų. Šiame darbe buvo identifikuoti 4 nauji termolabiliškos šarminės fosfatazės gamintojai ir naudojant siūlomą metodą, buvo atlikta lyginamoji PDPR analizė, skirta nustatyti šiuos mikroorganizmus. Remiantis palyginimu, buvo padaryta išvada, kad rasta gamintojai priklauso Alteromonas genties.

EKSPERIMENTO SĄLYGOS

Siekiant nustatyti termolubilios šarminės fosfatazės gamintojus, 50 μl jūros vandens buvo sumaltas ant maistinių medžiagų agaro paviršiaus ir buvo ištirtas, kaip aprašyta [11]. Mikroorganizmų biomasės gamyba buvo vykdoma auginant gamintojus 20 ° C temperatūroje sultinyje, kuriame buvo 1% triptoono (AGS GmbH, Vokietija), 0,5% mielių ekstrakto (tos pačios įmonės) ir druskos vandens (NaCl - 27,5, MgCl2 - 5, MgSO4 - 2, CaCl2 - 0,5, KCl-1, FeSO4 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2-7,7. Sėklos sultinys buvo paskirstytas 200 ml 700 ml rauginimo krosnies kolbose ir 16 valandų suplakamas su 150 apsisukimų per minutę.

Chromosomos DNR išskyrimas buvo atliktas pagal [13] metodą.

Ribosominės RNR 16S geno amplifikavimas buvo atliktas naudojant polimerazės grandininę reakciją, kaip aprašyta [14].

Dvigubos DNR ribos reakcija buvo atlikta 4 valandas 37 ° C temperatūroje 20 μl reakcijos mišinyje, kuriame buvo 2 vienetai. veikti riboti Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI arba RsaI, kuriuos gamina NPO SibEnzyme, atitinkamame buferyje. Reakcija buvo sustabdyta, įpilant 5 μl sustojimo tirpalo, turinčio 0,1 M EDTA, 0,05% bromfenolio mėlynojo ir 40% sacharozės.

Restruktūrizuotos amplifikuotos DNR produktų elektroforezinis atskyrimas buvo atliktas 2% agarozėje (Sigma) trisacetato buferyje su etidžio bromidu (0,5 mg / l), esant 120 V 4 valandoms.

Norint nustatyti DNR fragmentų ilgį, buvo naudojami DNR molekulinės masės žymekliai (100 pėdų +1,5 Kb DNR žymenys, NPO SibEnzyme). Nustatytų apribojimų nustatymas buvo atliktas naudojant kompiuterinę programą "Gel Pro Analyzer", versija 4.0.00.001. Fragmentų ilgio identiškumas procentais buvo apskaičiuotas kiekvienai mikroorganizmų pusei, kiekvienam restrikcijos fermentui palyginant restrikcijos modelius atskirai. Lyginant apribojimų ilgius, DNR fragmentai buvo laikomi identiškais, kurių ilgis skyrėsi ne daugiau kaip 5%.

Siekiant palyginti eksperimentinius duomenis su paskelbtomis 16S RNR geno sekomis, buvo naudojamas sekvencinių sekų genetinis duomenų bankas.

REZULTATAI IR APLINKYBIAVIMAS

Iš natūralių jūros vandens izoliatų išskirti keturi štampai - termoizoliacinės fosfatazės gamintojas, vadinamas 20, 27, 48 ir anksčiau aprašytu štamu [11], naudojant tradicinius Alteromonas undina metodus. Norint identifikuoti padermes, gautas iš mikroorganizmų, išaugintų skystoje maistinėje terpėje, pridedant jūros druskų biomasę, izoliuota chromosomų DNR.
Be to, chromosomos DNR buvo panaudota polimerazės grandinine reakcijoje, siekiant amplifikuoti ribosominės RNR 16S geną. Amplifikacijos produktas nepriklausomai buvo apdorotas 6 skirtingais restrikcijos endonukleazėmis. Visi mūsų naudojami apribojimai turi tetranukleotido atpažinimo vietą, todėl galima gauti nuo 3 iki 8 DNR fragmentų dėl suskaidymo amplifikacijos produkto, kuris yra apie 1500 nukleotidų ilgio. Naudojami Sse9I ir Tru9I restrikcijos fermentai turi atitinkamai AATT ir TTAA atpažinimo vietas, o BsuRI ir MspI restrikcijos fermentai supjaustomi per GGCC ir CCGG vietas. Restrikcijos svetainėse BstMBI ir RsaI, atitinkamai GATC ir GTAC, yra visi keturi nukleotidai. Toks apribojimų endonukleazių atranka, mūsų nuomone, turėtų užtikrinti universalumą nustatant mikroorganizmus, turinčius tiek turtingą AT turtingą, tiek GC daugybę genomų. Kiekybiniu požiūriu, kad tik šešių skirtingų apribojimo naudojimas mes tikime optimalus, nes apribojimo naudojimas endonukleazes 1 arba 3, kaip siūloma keliuose tyrimuose [10,15] negali aptikti polimorfizmas identifikuoti glaudžiai susijusių organizmų arba, alternatyviai, sukelti pernelyg didelių skirtumų Iz vienai ar daugiau atsitiktinių mutacijų. Tuo pačiu metu, naudojant 10 skirtingų ribojamųjų endonukleazių, dar nereiškia, kad DNR restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmas yra aiškiai per didelis [9].
1 paveiksle matyti sumodeliuoti naudojant kompiuterį vaizdo apribojimas genov16S RNR, mes pasiūlėme šešių restrikcijos fermentų (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI ir RsaI) rinkinį. 16S RNR genai paimti iš nuoseklių sekų genetinio banko. Mikroorganizmų pasirinkimas buvo gana atsitiktinis. Visos bakterijos priklauso skirtingoms giminėms ir yra tiek gramneigiamos, tiek gramteigiamos mikroorganizmų. Matoma, kad visiems mikroorganizmams yra unikalus apribojimų komplektas. DNR fragmentų skaičius svyruoja nuo 23 iki 30 (neatsižvelgiama į ilgio fragmentus, mažesnius nei 100 bazinių porų). Rezultatai apskaičiavimo proc tapatybės DNR fragmentų ilgis (restrikcijos fragmentas laikomi identiškais ilgiai skiriasi ne daugiau kaip 5%) skirtingų porų mikroorganizmų, kaip parodyta 1 lentelėje Ši lentelė rodo tik galimų porų mikroorganizmų parodyta Fig dalį. 1. Tačiau pateikti palyginimo rezultatai yra gana būdingi ir leidžia manyti, kad procentas DNR fragmentų ilgio identiškumo paprastai skiriasi nuo 12-28% skirtingų mikroorganizmų genčių atstovų. Taigi pateikti duomenys rodo, kad 16S RNR genų restrikcijos modelis su mūsų siūlomais restrikcijos fermentais gali tapti pagrindu identifikuoti bakterijų ląstelių genus.

Pav. 1. Teoriškai apskaičiuojamas modelis atskyrimą elektroforezės 16S RNR geno amplifikacijos produktų po apdorojimo su restrikcijos fermentais Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), MspI (4), BstMBI (5) ir RsaI (6). Dainos M - molekulinės masės žymeklis

16S RNR vertė sistemingai. Molekulinė hibridizacija 16S RNR.

16S rRNR molekulinė hibridizacija. Prokariotinė ribosoma susideda iš 3 subvienetų, didelių (23S), (5S) ir (16S). Gene 16S rRNR turi šias savybes, svarbias filogenijoje:

1. RNR ribosomos yra universalios skirtingoms rūšims, pavyzdžiui, patiems ribosomams. 2. 16S rRNR molekulė yra konservatyvi ir mažiausiai jautri pokyčiams biologinės evoliucijos eigoje. 16S rRNR geno pasikeitimo įvairiose simbiotinėse bakterijose greitis buvo 2-4% nukleotidų pakaitalų per 60 myr.3. 16S rRNR genas turi ir ultraaktyvius, ir kintamuosius regionus (domenus), kurie leidžia įvertinti tolimus ir glaudžius giminystės ryšius.4. Be to, nustatyta, kad rRNR cistronai nedalyvauja interspecific genetic transfer processes5. Geno dydis (prokariotuose, maždaug 1550-1640 bp ilgio) yra optimalus, palyginti su statistinių klaidų mažinimu. Visą seką galima nustatyti vienu nuoseklumu naudojant Sanger metodą. Nukleotidų katalogų palyginimas. Metodas buvo naudojamas 80-ųjų pradžioje ir buvo labai istoriškai svarbus bakterijų sistemingumui. Tuo pat metu RNR molekulė (16S rRNR) buvo apdorota ribonukleazė T, kuri suskaido molekulę į guanino likučius. Gautų fragmentų dydis buvo ne daugiau kaip 20 nukleotidų. Gautos oligonukleotidai buvo atskirti dvimatėmis elektroforezėmis, sekvencuojamos ir sukūrė katalogą, kuris specifiškai apibūdina rRNR molekulę. Lyginant katalogus, buvo atsižvelgta į fragmentus, kurių ilgis buvo mažiausiai 6 nukleotidai. Taikydamas katalogų panašumo koeficientus, pirmą kartą buvo sukurtas bendras filogenetinis medis prokariotams. Riboprinting. Šis metodas pagrįstas rRNR genų ribinės analizės metodu. Dėl to visa DNR izoliuojama iš ląstelės. Dvi gruntai, homologiški labai saugomiems 16S rRNR (mažo subvieneto ss rDNR) geno gretimiems regionams, yra paimti ir atlikti PCR. Fragmentai apdorojami keliomis restrikcijos endonukleazėmis, o kiekvienos endonukleazės restrikcijos produktai yra atskirti agarozės gelyje kartu su dydžio standartine DNR profiliu. Fragmento ilgio polimorfizmas atsiranda dėl to, kad dalis restrikcijos vietų patenka į konservatyvius genu domenus, o kai kurie - į kintamus domenus. Šioje fragmentų dalyje bus bendra visų rūšių mėginiai. Remiantis bendrų ir skirtingų fragmentų skaičiumi, galima apskaičiuoti genetinį atstumą tarp rūšių. Naudojant 12 restrikcinių fermentų su 4 nukleotidų ilgio atpažinimo vietomis, 16S rRNR geno ilgis gali būti padengiamas 10-15%, analizuojant be sekavimo.

Mielas mikrobasas

Valerijus Poroikas,
Čikagos universitetas, bendrosios chirurgijos katedra, Ph.D.
Populiari mechanika ı4, 2008

Prieš šimtą metų žmogaus žarnyne gyvenantys mikrobai buvo laikomi parazitais ir kenkėjais. Pastaraisiais metais žmogaus mikrobiota buvo vadinama mūsų kūno organu, būtinu normaliam kūno funkcionavimui.

Pasteuro laiko metu buvo žinoma, kad žmogaus virškinimo traktas iš esmės yra srauto tipo bioreaktorius, kuriame gyvena daug mikroorganizmų. Žmonių požiūris į žarnyno mikroflorą per šį laiką radikaliai pasikeitė. Prieš šimtą metų, didysis Ilja Mechnikov, šiuolaikinės teorijos imuniteto įkūrėjas, kūrimui, kurių jis gavo Nobelio premiją (dviems žmonėms su jo nenumaldomas priešininkas, ne mažiau nei puikus Paulius Ehrlich), net pasiūlė dvitaškis šalinimas kaip prailginti gyvenimo būdas. Ir tiems, kuriems ši priemonė atrodė pernelyg radikali, aš rekomendavo gerti kuo daugiau kefyro, kad galėtumėte slopinti kenksmingus, jo nuomone, mikrobus su naudingomis pieno rūgšties bakterijomis. Po pusės amžiaus kursas pasikeitė 180 laipsnių. Paaiškėjo, kad normalus žarnyno mikrofloras, o taip pat oda ir gleivinės, atlieka daug naudingų funkcijų - pavyzdžiui, jis slopina patogeninių mikroorganizmų gyvybinę veiklą, nuolat atakuoja kūną. Ir pastaraisiais metais labiausiai drąsūs mikrobiologai nuėjo dar toliau, paskelbdami žmogų ir jo mikrobus kaip vieną simbiotinį superorganizmą.

Molekulinės biologijos metodų kūrimas atnešė mokslininkams naują supratimą apie žmogaus ir jo mikrofloros simbiozės procesus, kurie atrodė gerai studijuoti ir nesitikėjo jokių ypatingų staigmenų tolesniam tyrimui. Spartus greičio augimas ir DNR sekos nustatymo metodų (nustatant jo nukleotidų seką) ir lygiagrečiai didėjant asmeninių kompiuterių galiai ir interneto plėtojimui sumažėjo išlaidos, leidžiančios išanalizuoti informaciją apie didelius genomo regionus. Po šimtų atskirų bakterijų rūšių chromosomų išaiškinimo atsirado naujas požiūris į mikroorganizmų genetiką - gyventojų pagrindu: vienu metu analizuojant tam tikrų sričių bakterijų genus. Žinoma, "žmogaus bioreaktoriaus" populiacija pasirodė esanti viena iš svarbiausių mikrobų populiacijų tyrimo.

Pirmasis darbas, dėl kurio visiškai iš naujo atrodė žarnyno mikrobiota, 1999 m. Paskelbtas Nacionalinio agronominių tyrimų instituto (Prancūzija) ir Readingo universiteto (Didžioji Britanija) mokslininkų grupės. Autoriai nusprendė taikyti 16S RNR genų sekvenavimo metodą žarnyno mikrobų populiacijos tyrimui (žr. Šoninę juostą).

16S PHK - Bacter ID

Pirmasis žingsnis nustatant mikroorganizmus yra jų auginimas maistingųjų medžiagų terpėje. Tačiau daug mikrobų nenori augti jokiame terpėje.

Šiuolaikinės technologijos
Tyrimo anksčiau neprieinamų ne-culturable bakterijų ir pradėti taikyti tvarką visiškai paini taksonomi jau žinomas prokariotinės tapo įmanoma su bioinformatikos plėtros ir modernių metodų molekulinės biologijos atsiradimo - PGR leidžia viena DNR sritį gauti milijardus kopijos, klonavimo pasirinktą geną bakterijų plazmidžių ir sekos sekas metodikas nukleotidai, gauti pakankamu kiekiu analizei. Puiki žymeklis identifikavimo mikroorganizmų įrodyta, genas, koduojantis 16S rRNR (kiekvienas iš dviejų ribosomų subvienetų - dirbtuvių ląstelių baltymų sintezę - sudaro iš supintų grandines baltymų molekulių ir ribonukleino rūgštis).

Puikus žymeklis
Šis genas yra visų žinomų bakterijų ir archeų genomo, bet jis nėra eukariotams ir virusams, o jei jūs nustatėte savo būdingą nukleotidų seką, jūs tikrai elgiatės su prokariotų genais. Šis genas turi tiek konservatyvius regionus, tiek ir visiems prokariotams ir konkrečioms rūšims. Konservatyvios svetainės naudojamos pirmajam polimerazės grandininės reakcijos etapui - bandomosios DNR priklijuojamos į pradmenis (DNR sėklų patalpos, į kurias tiriamajai nukleotidų grandinei reikia prisijungti, kad būtų galima pradėti analizuoti likusius sekos etapus), o konkrečiai rūšiai - rūšiai nustatyti. Rūšių specifiškų sklypų panašumo laipsnis atspindi skirtingų rūšių evoliucinę giminingumą. Klonavimui ir vėlesnei analizei galite naudoti pačią ribosominę RNR, kuri yra bet kurioje ląstelėje didesniu kiekiu nei jo atitinkamas genas. Visų žinomų bakterijų ir archeų 16S RNR nukleotidų sekos yra plačiai prieinamos. Nustatytos sekos palyginamos su duomenimis bazėse ir identifikuojamos bakterijų rūšys arba pripažįstamos, kad jos priklauso neperdirbtoms rūšims.

Nauja taksonomija
Pastaruoju metu intensyviai persvarstyta senoji, fenotipinė bakterijų klasifikacija, pagrįsta blogai formalizuotomis kriterijais: nuo kolonijų atsiradimo iki maisto produktų pasirinkimo ir gebėjimo dažyti įvairiais dažais. Naujoji sistematika pagrįsta molekuliniais kriterijais (16S RNR) ir tik iš dalies pakartoja fenotipinę.

Ką turime viduje

Koduojančių sekų 16S RNR polimerazės grandinės reakcija (PGR) buvo atšaukta tiesiogiai iš "aplinka" - 125 mg žmogaus, atsiprašau, išmatose buvo įterptas į E. coli (ne todėl, kad žarnyno plazmidės, ir dėl to, Escherichia coli - yra FAVE molekulinių biologų darbo kolekcijos) ir vėl išskirti iš dauginamos bakterijos kultūros. Taigi, buvo sukurtas visų mėginių mikroorganizmų 16S RNR genų biblioteka. Po to 284 klonai buvo atsitiktinai parinkti ir sekvencuoti. Pasirodo, kad tik 24% gautų 16S RNR sekų priklausė anksčiau žinomiems mikroorganizmams. Daugiau nei šimtą metų trys ketvirtadaliai kiekvieno žmogaus žarnyno mikrofloros vengia mokslininkų, ginkluotų klasikinės mikrobiologijos metodais, dėmesį! Mokslininkai tiesiog negalėjo rasti šių bakterijų auginimo sąlygų, nes labiausiai nerūpestingos žarnyno gyventojai atsisakė augti tradicinėje mikrobiologinėje terpėje.

Šiandien, naudojant molekulinius metodus, buvo nustatyta, kad 10 iš 70 didelių bakterijų taksonų yra suaugusio mikrobiota. Apie 90% mūsų mikrobų priklauso firmicutes tipo (tai apima, pavyzdžiui, garsaus laktobakterijos - pagrindinis "kaltininkas" souring pienas) ir bacteroidetes - įpareigoti anaerobai (organizmų, kurie gali gyventi tik nesant deguonies), kurios yra dažnai naudojamas kaip taršos rodikliu natūralių vandenų nuotekos. Likę 10% gyventojų padalintas tarp taksonų proteobakterijos (Tai apima, be kita ko, E. coli), Actinobacteria (nuo vienos iš aktinomicetų antibiotikų streptomicino rūšių buvo izoliuotas), Fusobacteria (normalus gyventojų burnos ertmės ir dažnai sukelia periodontitas), Verrucomicrobia (neseniai geoterminis šaltinis buvo atrastas mikrobų, mintančių metano, kurios gausu žarnyne dėl kitų mikroorganizmų), melsvabakterės (jie vis dar dažnai vadinami senosios formą - "mėlyna-žalia dumblių»), spirochetas (laimei ND, o ne šviesiai), Synergistes ir VadinBE97 (kokios gyvūnų, kreipkitės į naują taksonomijos prokariotų kūrėjus).

Mikrobinis mus yra labiau nei žmogus

Šiuo tikslu naudojamos automatizuotos, kompiuterizuotos ir aukštos kokybės DNR sekos nustatymo technologijos, leidžiančios analizuoti trumpas nukleotidų sekas, surinkti galvosūkį keliais atitinkamais raidėmis šių sekcijų galuose, pakartotinai pakartoti šią procedūrą kiekvienam genomo gabalui ir gauti atskirų genų ir chromosomų dekodavimą esant greičiui iki 14 milijonų nukleotidų per valandą - greičiau nei prieš keletą metų. Taigi buvo nustatyta, kad žarnyno mikrobiota turi apie 100 trilijonų bakterijų, ty apie dešimt kartų daugiau nei bendras ląstelių kiekis žmogaus organizme.

Genų, sudarančių bakterijų metagenomą, rinkinys yra apie šimtą kartų didesnis nei žmogaus kūno genų rinkinys. Jei mes kalbame apie mikroorganizmų populiacijoje esančių biocheminių reakcijų kiekį, tai yra daug kartų didesnė už biocheminių reakcijų kiekį žmogaus kūne.

Bakterinis "reaktorius" šeimininko organuose vykdo medžiagų apykaitos grandines, kurių jis pats negali palaikyti - pavyzdžiui, vitaminų ir jų pirmtakų sintezė, tam tikrų toksinų skilimas, celiuliozės skaidymas į virškinamus polisacharidus (atrajotojams) ir kt.

Nuo kūdikio iki senatvės

Nepaisant to, kad žarnyno mikroorganizmų rūšinė sudėtis yra gana vienarūšė, tam tikrų sisteminių grupių atstovų kiekybinis santykis skirtingų žmonių mikrobiota gali labai skirtis. Bet kas yra normalus žarnyno mikrofloras ir kokie yra jo formavimo būdai?

Šis klausimas buvo pateiktas 2007 m. Stanfordo universiteto Patrick Browno vadovaujamos Amerikos biologų grupės darbe. Per pirmuosius gyvenimo metus jie atsirado 14 naujagimių mikrobiota. Autoriai sugebėjo nustatyti keletą kolonizacijos virškinimo trakto šaltinių šaltinių. Kūdikių mikrobiotai turėjo panašumų su motinos mikroflora: makšties, fekalijos ar motinos pieno mėginių mikrofloros. Priklausomai nuo kolonizacijos šaltinių, pirmųjų gyvenimo metų metu žinduolių mikrofloroje dominavo skirtingos rūšys. Šie skirtumai išliko reikšmingi visą studijų laikotarpį, tačiau vienerių metų amžiuje pastebimas suaugusiųjų mikrobiota susidarymas. Įdomūs duomenys buvo gauti dvynių poros pavyzdžiu. Juose mikroflorai buvo beveik identiški ir taip pat pasikeitė. Ši išvada parodė milžinišką mikroorganizmo poros mikroorganizmo komponento vaidmenį formuojant žarnyno mikrofloros populiaciją. Dėl eksperimento grynumo, žinoma, kūdikius būtina atskirti vis dar ligoninėje (beje, nuostabi istorija, skirta Indijos filmei! Per pastaruosius dvyniai susipažįsta tarpusavyje iš mikrofloros analizės). Tačiau kitų tyrimų rezultatai patvirtino prielaidą, kad žmogaus, įskaitant paveldimus, žmogaus biocheminės savybės, turi didelę įtaką jo mikrobiota.

Plonas ir storas

Jeffrey Gordono (Vašingtono universiteto Vaikų universiteto Medicinos mokykloje, St. Louis, Missouri) laboratorijoje atlikti tyrimai leido susieti virškinamojo trakto bakterijų rūšinę įvairovę su žmogaus mityba ir metabolinėmis savybėmis. Eksperimento rezultatai buvo paskelbti 2006 m. Gruodžio mėn. "Nature" žurnalo numeriu. Vienerių metų eksperimentas pasiūlė nustatyti koreliaciją tarp žmogaus liekninio svorio ir žarnyno mikrobų populiacijos sudėties. Dešimt riebalų žmonių, kurie sutiko paversti savo skrandžius mokslo altoriuje, buvo suskirstyti į dvi grupes. Vienas iš jų vartojo mažai riebalų turinčią dietą, kita - dietą su mažu angliavandeniu. Visi savanoriai prarado svorį ir tuo pačiu metu pakeitė dviejų pagrindinių žarnyno mikroorganizmų grupių santykį: sumažėjo Firmicutes ląstelių skaičius, o priešingai - padidėjo bakteriodezių skaičius. Mažai riebalų dieta toks pakeitimas tapo pastebimas vėliau - po to, kai pacientai prarado 6% savo svorio, o mažai angliavandenių dietos - praradę pirmuosius kilogramus (2% jų pradinio svorio). Tuo pačiu metu, mikrofloros sudėtis pasikeitė dar ryškesnė, tuo mažiau tapo eksperimento dalyvių svoris.

Kova su nutukimu

Mokslininkų tolesnio tyrimo, atlikto simbiozinio pelių ir mikrobų organizmo pokyčių (žr. Dėžutę "Išbandyta pelėms"), rezultatai puikiai patvirtino hipotezę, kad nutukusių žmonių mikrobiota prisideda prie gilesnio maisto perdirbimo. Nutukimo ir normalaus pelių DNR mėginių išmatų palyginimas parodė, kad nutukimo mikrobiomos yra prisotintos fermentų genais, kurie leidžia efektyviau skaidyti polisacharidus. Riebalų pelių žarnose buvo daug fermentavimo galutinių produktų - acto rūgšties ir sviesto rūgščių junginių, kurie rodo gilesnį maisto komponentų perdirbimą. Kalorimetrinė (iš žodžio "kalorijos"!) Pelenų išmatų tyrimo analizė patvirtino tai: ob / ob pelių išmatose buvo mažiau kalorijų nei laukinės rūšies pelių, kurios visiškai neperdegė energijos iš maisto.

Be svarbios informacijos apie "mikrobų" nutukimo sudedamąją dalį, autoriai sugebėjo parodyti pagrindinį mikrofloros panašumą į nutukusius žmones ir pelių, o tai atveria naujas perspektyvas tiriant antsvorio problemą ir galbūt šios problemos sprendimą "persodindami" sveika mikroflorą ar jos susidarymą pacientams nutukusi.

Išbandyta pelėms

Ir išnykęs

Tai, kad mikrobiota gali kontroliuoti šeimininko metabolizmą, nebegali abejoti. Mokslinių tyrimų laboratorija Gordonas, skirta antsvorio problemai, leido mesti tiltą į medžiagų apykaitos ligų gydymą. Tarp jų yra tokie bendrojo išsekimo tipai, kurie nuo vienerių iki ketverių metų daro vaikus neturtingose ​​šalyse, turinčiose atogrąžų klimatą, pavyzdžiui, marasmą (šis žodis turi tik kalbinį ryšį su marasmu: graikų marasmozas reiškia išnykimą, išnykimą) ir kwashiorkor (vienos iš giminių kalba Gana kwashiorkor - "raudonasis berniukas"). Ligos atsiradimas yra susijęs su baltymų ir vitaminų trūkumu pereinant nuo maitinimo krūtimi į suaugę maistą. Tačiau ligos selektyviai paveikia vaikus, kurių broliai ir seserys neturėjo jokių problemų pereinant prie tradicinės regiono mitybos. Tyrimai parodė, kad sergančių vaikų žarnyno mikrofloras labai skiriasi nuo tėvų mikrofloros, taip pat nuo sveikų brolių ir seserų mikrofloros. Visų pirma buvo pastebėta beveik visiško bakteroidų žarnyno populiacijos nebuvimas ir retų rūšių, priklausančių proteobakterijų ir fosobakterijų rūšims, dominavimas. Po sergančių vaikų (kruopščiai, kad nebūtų perdozavimo!) Buvo tiekiami intensyviai baltyminiai maisto produktai, jų mikrobiota atrodė kaip normalus, kaip antai giminaičiuose, su Bactrotetes ir Firmicutes paplitimu.

Naujausi tyrimai ne tik iš esmės pakeitė dabartinį žmogaus žarnyno mikrofloros supratimą, bet ir prisidėjo prie koncepcijos, pagal kurią žarnyno mikrobiota laikoma papildomu daugiasluoksniu žmogaus "organu", atsiradimą. Organas, susidedantis iš įvairių ląstelių linijų, galinčių bendrauti tarpusavyje ir su šeimininku. Kūnas, kuris perskirsto energijos srautus, atlieka svarbias fiziologines reakcijas, keičiasi aplinkos įtakoje ir savireguliavo, kai pokyčius sukelia išorinės sąlygos. Tolesnis "bakterijų organų" tyrimas gali ir turėtų padėti suprasti jo funkcionavimo įstatymus, atskleisti jo subtilius ryšius su šeimininko organizmu ir dėl to atsiradus naujiems kovos su žmogaus ligomis metodams taikant tikslingą abiejų metaorganizmo komponentų disfunkcijų gydymą.

16s rna analizė

Ribosominės ribonukleino rūgštys (rRNR) yra kelios RNR molekulės, kurios sudaro ribosomos pagrindą. Pagrindinė rRNR funkcija yra atlikti vertimo procesą - skaityti informaciją iš mRNR, naudojant tRNR adapterio molekules, ir katalizuojant peptidinių ryšių susidarymą tarp tRNR prisijungusių amino rūgščių.

Turinys

Ribosominės dalinės dalys ir rRNR nomenklatūra

Apie elektroninių mikroskopinių nepažeistų ribosomų vaizdus pastebima, kad jie susideda iš dviejų dalelių su skirtingais dydžiais.

Sumažintų dalelių masės santykis

2: 1; Savo ruožtu masės išreiškiamos tiesiogiai išmatuotos sedimentacijos konstantomis (nuosėdų greitis Svedbergo vienetuose, S) per ultracentrifugavimą, todėl šis parametras sudarė rRNR nomenklatūrą ir ribosomas bei ribosomų dalinius pagrindus: naudojami tipų pavadinimai

Pavyzdžiui, prokariotų ribosominė RNR su nuosėdų koeficientu 16 Svedbergo vienetų yra priskiriama 16S rRNR.

Kadangi sedimentacijos koeficientai priklauso ne tik nuo molekulinės masės, bet ir nuo dalelių formos, sedimentacijos koeficientai disociacijos metu yra nesuderinami: pavyzdžiui, bakterijų ribosomos su molekuline masė

3 * 10 6 Daltono sedimentacijos koeficientas yra 70S, žymimas 70S ir dissociuojamas į 50S ir 30S subvienetus:

Kiekviename ribosominiame subvienete yra viena ilgalaikio rRNR molekulė, kurios masė yra

1/2 - 2/3 ribosominės dalelės masės, taigi, bakterijų 70S ribosomų atveju 50S subvienetas yra 23S rRNR (ilgis

3000 nukleotidų) ir 30S subvienetas yra 16S rRNR (ilgis

1500 nukleotidų); Be "ilgosios" rRNR, didelis ribosominis subvienetas taip pat turi vieną arba du "trumpus" rRNR (5S rRNR iš bakterijų ribosominių subvienetų 50S arba 5S ir 5.8S rRNR iš didesnių ribozomų dalių eukariotams).

Sintezė

Ribosominė RNR sudaro didelę (iki 80%) visų ląstelių RNR dalį, tokia rRNR koncentracija reikalauja intensyvios transkripcijos jos koduojančių genų. Šis intensyvumas yra gaunamas daugybe rRNR koduojančių genų kopijų: eukariotuose yra kelios šimtai (

200 mielėse) iki dešimčių tūkstančių (skirtingų linijų medvilnės, apie 50-120 tūkstančių kopijų) genų, organizuotų tandeminių kartojimų masyvuose.

Žmonėms genai, koduojantys rRNR, taip pat yra suskirstyti į grupes tandeminių pakartojimų, esančių 13, 14, 15, 21 ir 22 chromosomų viduriniuose regionuose.

Jie yra sintezuojami RNR polimerazės I forma ilga miokliu prieš ribosominę RNR, kuri yra supjaustyta į atskiras RNR, kurios sudaro ribosomų pagrindą. Bakterijose ir archeoje pradiniame stenograma paprastai yra 16S, 23S ir 5S rRNR, tarp kurių ištrinamos išankstinės rRNR sekos. Paprastai tarp 16S ir 23S rRNR genų yra vienas ar daugiau tRNR genų; taigi, E. coli, tokios genų grupės pradinis stenogramas turi tokią seką:

(16S rRNR) - (1-2 tRNR) - (23S rRNR) - (5S rRNR) - (0-2 tRNR)

Toks transkriptas yra suskaidytas į išankstinio rRNR ir tRNR fragmentus fermento ribonukleazės III.

Eukariotose 18S, 5.8S ir 25/28 rRNR yra bendrai transkribuojami su RNR polimeraze I, o 5S rRNR genas transkribuoja RNR polimerazė III.

Eukariotose rRNR koduojančių genų koncentracijos vietos paprastai gerai matomos ląstelės branduolyje dėl aplink juos kaupiamų ribosomų subvienetų, kurie yra iškart surinkti. Šie klasteriai gerai dažomi citologiniais dažais ir yra žinomi kaip branduolys. Atitinkamai, nukleozių buvimas būdingas ne visoms ląstelės ciklo fazėms: ląstelių dalijimasis profaze nukleozė dissociuoja, nes rRNR sintezė suspenduojama ir reformuojama telofazės pabaigoje, kai atnaujinama rRNR sintezė.

Pro ir eukariotinės rRNR lyginamoji analizė

Prokariotų ir eukariotų ribosominės RNR (panašios į ribosomas) skiriasi viena nuo kitos, nors jie rodo didelį sekų regionų panašumą. 70S prokariotinė ribosoma susideda iš didelio 50S subvieneto (pagaminto iš dviejų rRNR molekulių - 5S ir 23S) ir mažo 30S subvieneto (pagaminto remiantis 16S rRNR). 80S eukariotinė ribosoma susideda iš didelio 60S subvieneto (pagaminto iš trijų rRNR molekulių - 5S, 5.8S ir 28S) ir mažo 40S subvieneto (pagaminto remiantis 18S rRNR).

Naudojant sekos informaciją

Informacija apie konkretaus organizmo rRNR yra naudojama medicinoje ir evoliucinėje biologijoje.

  • RRNR genas yra vienas iš labiausiai konservatyvių (mažiausiai kintančių) genų. Todėl sisteminė organizmo būklė ir laikas, kai skiriasi su artimais gyvūnais, gali būti nustatomi rRNR sekų panašumų ir skirtumų analizės pagrindu.
  • rRNR yra daugelio antibiotikų, kurių kai kurie klinikinėje praktikoje naudojami tiek bakterijų (antibiotikų, kurie rišasi su prokariotine ribosoma) augimą, tiek ir žmonių ligų (antibiotikų, kurie rišasi su eukariotine ribosoma), augimą. Pirmoji grupė apima chloramfenikolą, eritromiciną, kasugamiciną, mikrokoksiną, spektinomiciną, streptomiciną, tiostreptoną. Ant antrojo higromicino B paromomicino.

Ankstesnis Straipsnis

Essentiale Forte N

Susiję Straipsniai Hepatito